代谢研究NMT标准化方案
代谢研究NMT标准化方案
一、视频资源
二、参考文献
Leaf Extract from Lithocarpus polystachyus Rehd. Promote Glycogen Synthesis in T2DM Mice
Abnormal mitochondrial function impairs calcium influx in diabetic mouse pancreatic beta cells
Oscillatory glucose flux in INS 1 pancreatic β cells: A selfreferencing microbiosensor study
Oxygen consumption oscillates in single clonal pancreatic beta -cells (HIT)
三、常测哪些指标
Ca2+、H+、O2、葡萄糖
四、检测这些离子流、分子流，有什么生物学意义
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2）科研案例
使用患有糖尿病的KK-Ay小鼠和正常的C57BL/6J小鼠的胰腺β细胞研究了线粒体的功能和形态，Ca2+通道，并且使用非损伤微测技术（NMT）测定了葡萄糖诱导的Ca2+内流。实验发现，葡萄糖诱导正常胰腺β细胞的Ca2+内流增加，但是KK-Ay的Ca2+并没有发生明显变化，当加入genipin后，能够恢复KK-Ay小鼠胰腺β细胞的Ca2+内流。因此，在患有糖尿病小鼠的胰岛β细胞中，缺失线粒体功能是改变Ca2+内流导致的胰岛素分泌异常的重要因素。胰岛组织（Islet）是非常适合用于非损伤微测技术测定的材料，具有稳定而明显的Ca2+、H+和K+的流速，这为研究糖尿病的机理提供了重要的活体手段。
Li F, Porterfield DM, Zheng XY, Wang WJ, Xu Y, Zhang ZM. Abnormal mitochondrial function impairs calcium influx in diabetic mouse pancreatic beta cells. Chin Med J (Engl). 2012;125(3):502-510.
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1）O2生理功能概述
2）科研案例
通过测定L6肌肉细胞生理状态的UCP3超表达对葡萄糖和脂肪酸氧化，对线粒体解偶联和ROS产生的影响，以及用非损伤微测技术测定了细胞的耗氧。实验发现肌肉细胞温育在血糖正常或者血糖过高的环境中导致棕榈酸氧化增加，但是，腺病毒绿色荧光蛋白感染或者慢性低剂量的解偶联剂二硝基苯酚对棕榈酸氧化没有影响。增加UCP3不影响葡萄糖的氧化，但是二硝基苯酚和胰岛素处理引起了葡萄糖氧化的增加。二硝基苯酚引起耗氧的增加和线粒体膜电势的下降，但是增强UCP3表达没有引起线粒体膜电势改变。最后，线粒体ROS随着UCP3表达的增加显著下降。通过非损伤微测技术研究UCP3引起的耗氧变化，为糖尿病药物开发和筛选提供了活体检测的手段。
MacLellan JD, Gerrits MF, Gowing A, Smith PJ, Wheeler MB, Harper ME. Physiological increases in uncoupling protein 3 augment fatty acid oxidation and decrease reactive oxygen species production without uncoupling respiration in muscle cells. Diabetes. 2005;54(8):2343-2350.
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2）科研案例
取活体小鼠肝脏组织，添加外源葡萄糖后，利用NMT可以观测到肝脏组织对葡萄糖的吸收逐渐增加，在加入外源巴马甜茶提取物后，肝脏组织吸收葡萄糖的速率瞬间上升2-3倍，且在较高的吸收速率水平上维持一段时间。首次通过在体实验展示了巴马甜茶提取物急性降血糖的潜力。
Wang J, Huang Y, Li K, et al. Leaf Extract from Lithocarpus polystachyus Rehd. Promote Glycogen Synthesis in T2DM Mice. PLoS One. 2016;11(11):e0166557.
五、如何应用NMT开展糖尿病活体组织水平研究
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近年来，世界各国糖尿病的患病率均有极具增加的趋势，据WHO统计，1994年糖尿病患者人数为1.20亿，1997年为1.35亿，2000年为1.75亿，2010年为2.39亿，2017年为4.25亿。目前，世界糖尿病患者人数最多的前3位国家为印度、中国、美国，据国际糖尿病联盟最新数据，2017年全球的4.25亿糖尿病患者中，中国是患病人数达到1.14亿，并呈现发病率升高、患者年轻化的趋势。糖尿病给患者带来的并发症有160余种，其中80%的糖尿病患者死于心脑血管疾病，而治疗糖尿病及其并发症的费用占据国家整个医疗支出的7%-13%。
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- 指标的契合度：葡萄糖指标，提供了研究中最直接的指标测量。
- 检测材料广：在细胞水平，组织水平都能进行检测，给与研究者不同材料水平的检测方式，达到同一研究方向、不同材料水平都能进行测量。
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1）ZHANG Zong-ming,et al. Abnormal mitochondrial function impairs calcium influx in diabetic mouse pancreatic beta cells. Chinese Medical Journal. 2012,125(3):502-510.点击查看全文
2）J. Darcy MacLellan, et al. Physiological Increases in Uncoupling Protein 3 Augment Fatty Acid Oxidation and Decrease Reactive Oxygen Species Production Without Uncoupling Respiration in Muscle Cells. Diabetes. 2005,54:2343-2350.点击查看全文
3）D. Marshall Porterfield , et al.Oxygen consumption oscillates in single clonal pancreatic beta -cells (HIT). Diabetes.2000,49:1511-1516.点击查看全文
4）D. Marshall Porterfield, et al. Oscillatory glucose flux in INS 1 pancreatic β cells: A selfreferencing microbiosensor study. Analytical Biochemistry. 2011,411(2): 185–193.点击查看全文
5）Yingbai Shen, et al. Leaf Extract from Lithocarpus polystachyus Rehd. Promote Glycogen Synthesis in T2DM Mice. PLoS One. DOI:10.1371/journal.pone.0166557 2016.点击查看全文
六、如何应用NMT开展活体组织代谢研究
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- 组织器官水平研究
随着研究的深入，单细胞的生理状态，以及对不同环境的生理反应，与处于机体组织器官中的细胞的差异，已逐渐成为研究中的瓶颈。NMT不仅可以检测单细胞，还可以实现对细胞的原位检测，以及对活体组织器官的在体检测，很好地弥补了这一研究手段的空白。
- 活体研究
可在离体或在体的情况下，对活体组织，开展代谢研究，无需提取、无需染色。
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1）Wang J, et al. Leaf Extract from Lithocarpus polystachyus Rehd. Promote Glycogen Synthesis in T2DM Mice. Plos One. 2016, 11(11):e0166557.点击查看全文
2）D. Marshall Porterfield , et al. Oxygen consumption oscillates in single clonal pancreatic beta -cells (HIT). Diabetes.2000,49:1511-1516.点击查看全文
3）Land SC, et al. O2 availability modulates transmembrane Ca2+ flux via second-messenger pathways in anoxia-tolerant hepatocytes. Journal of Applied Physiology.2009, 82:776-783, 1997.点击查看全文
4）D. Marshall Porterfield, et al. Oscillatory glucose flux in INS 1 pancreatic β cells: A selfreferencing microbiosensor study. Analytical Biochemistry. 2011,411(2): 185–193.点击查看全文
5）J. Darcy MacLellan, et al. Physiological Increases in Uncoupling Protein 3 Augment Fatty Acid Oxidation and Decrease Reactive Oxygen Species Production Without Uncoupling Respiration in Muscle Cells. Diabetes. 2005,54:2343-2350.点击查看全文
6）ZHANG Zong-ming,et al. Abnormal mitochondrial function impairs calcium influx in diabetic mouse pancreatic beta cells. Chinese Medical Journal. 2012,125(3):502-510.点击查看全文
七、可以检测哪些样品
1、动物样品
1）细胞
神经细胞、肿瘤细胞、巨噬细胞、淋巴细胞等
2）组织器官
肿瘤、皮肤、胃粘膜、胰岛、脑（海马体等）、胚胎（大鼠、鱼）、斑马鱼皮肤/鳃、耳蜗、心脏（香螺）、卵（鱼、鸡蛋、爪蟾）、骨骼、角膜、脊椎（豚鼠）、肌肉组织（肌纤维、心肌）
3）其它动物样品
珊瑚、螨虫、昆虫（果蝇幼虫的肠、蟑螂血脑屏障、按蚊、长红锥蝽）、蝌蚪、水蛭、蓝蟹（微感毛）、变形虫、水丝蚓
2、植物样品
1）营养器官
茎：边材、心材、微管形成层、木质部
2）生殖器官
花：花瓣、花瓣表皮细胞、花粉
种子：整体、胚
果实：果壳、果皮、果肉（苹果、柑橘）、籽粒、棉花纤维、棉桃
3）细胞：植物悬浮细胞、液泡
4）愈伤组织
3、微生物样品
酵母细胞、菌丝、菌落、微藻、细菌（大肠杆菌）
4、其它生物样品
周丛生物
5、非生物样品
金属、混凝土、泥沙、纳米材料、生物医药材料
八、样品需要做哪些前处理
国际领先的非损伤微测技术最大的特点就是活体、无损检测，因此动植物材料在检测前，不需要任何的液氮速冻、染色、研磨处理等。
1、动物单细胞
因NMT是活体检测，故从培养箱中拿出来后，置于培养皿中，直接检测即可。
2、动物组织
因NMT是活体检测，无需提前处理。如检测部位天然暴露在外，如斑马鱼皮肤离子细胞、侧线毛细胞，直接检测即可。如检测部位位于体内，需在检测时暴露出检测部位（可采用麻醉的方式），后检测即可。
3、植物根茎叶等组织器官
天然暴露在外的组织器官，例如根、茎、叶的表面，无需任何处理，直接检测即可。水培、土培、砂培、平板培养均可。
4、植物原生质体/液泡
因NMT是基于微传感器/探针的非损伤检测，检测时不接触样品，故原生质体、液泡需要从组织或者细胞中，提取出来后检测。
5、植物叶片的表皮细胞、叶肉细胞、盐腺细胞、保卫细胞
无需提前处理。因这些细胞处于组织内部，故检测时采用撕取等方式，暴露出相应细胞即可。
6、植物花粉管
离体萌发：在培养皿中萌发一段时间后即可直接检测；在体萌发：将柱头置于培养皿中，待萌发一段时间后即可直接检测。
7、植物果实
无需提前处理。如待测部位位于果实内部，需在检测前暴露出相应部位即可。
8、植物悬浮细胞
无需提前处理。检测时，置于培养皿中检测即可。
九、有哪些检测方式？
即瞬时处理，是指在检测过程中，在正常测试液中瞬间加入所需的干旱胁迫溶液（PEG或甘露醇等溶液）的处理方法，目的是为了观察瞬间干旱胁迫下，样品短时间内的离子/分子的变化趋势，即短时效应。
2、预处理/提前处理好后检测
是指在干旱胁迫一段较长的时间后（数十分钟/数小时/数天），观察植物离子/分子进出的情况，即长时效应。
十、检测环境是空气还是溶液
检测时，只要求待测部位浸于溶液中（无需整体都浸在溶液里）。
十一、样品是如何检测的
十二、可以送样检测吗
可以送样检测。目前非损伤微测技术测试服务由中关村NMT产业联盟统筹管理，由遍布全国的25家NMT创新平台服务中心，提供检测服务。点击获取测试服务
